Mol Psychiatry︱叶克强课题组揭示C/EBPβ/AEP信号通路介导了动脉粥样硬化及其诱发的阿尔兹海默症

撰文︱叶克强，王蒙蒙

责编︱王思珍

动脉粥样硬化（atherosclerosis，ATH）和阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）都是年龄依赖性的炎症性疾病，其发展均与浸润的巨噬细胞和血管病理学相关，且两种疾病具有多种共同的致病因素[1-4]。C/EBPβ/AEP信号通路和与ATH和AD密切相关。天冬酰胺内肽酶（asparagine endopeptidase，AEP）是一种酸性激活的半胱氨酸蛋白酶，在人脑中随年龄增长和激活，作为δ-分泌酶通过剪切APP和Tau加速Aβ的产生和Tau的聚集促进AD的发病[5]。AEP的小分子抑制剂可阻断AD病变，改善其认知功能障碍[6]。另一方面AEP也是动脉粥样硬化的新型标志物，颈动脉动脉粥样硬化患者的颈动脉斑块和血浆中的AEP均增加[7-9]，ApoE^-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块中AEP表达水平也显著升高[10]。C/EBPβ是一种炎性细胞因子激活的转录因子，同时在肝脏和脂肪组织调节脂质代谢[11, 12]。本文研究者前期已经证明C/EBPβ在衰老过程中调节AEP[13]，且C/EBPβ/AEP信号传导时空介导AD发病机制[14]。另已有研究表明ApoE^-/-小鼠造血细胞中C/EBPβ的缺失可减少炎症和高脂血症，从而缓解动脉粥样硬化发展[15]。此外，C/EBPβ在炎症调控中也有重要作用[16]。最近，本文研究者发现发现ApoE4和27-羟基胆固醇（27-OHC）加性激活C/EBPβ/AEP通路，驱动AD发病[17]。ApoE4和胆固醇是ATH和AD共同的关键效应物，但C/EBPβ/AEP信号通路是否将ATH与AD病理学结合起来，其相关机制仍不完全清楚。

2022年4月14日，埃默里大学的叶克强课题组在《分子精神病学》（Molecular Psychiatry）上发表了题为“C/EBPβ/AEP signaling couples atherosclerosis to the pathogenesis of Alzheimer’s disease”的研究论文，提出C/EBPβ/AEP是ATH和AD的共同机制：C/EBPβ/AEP通路介导ATH病理发生并将ATH与AD偶联，因此解释了动脉粥样硬化是如何促进老年痴呆症的发生。廖建明和陈贵勤为论文共同第一作者，叶克强教授为论文通讯作者。

为了研究C/EBPβ/AEP信号传导在动脉粥样硬化形成中的作用，研究者分别将C/EBPβ^+/-（C/EBPβ^-/-小鼠表型复杂且难以繁殖[18]）和 AEP^-/-小鼠与ApoE^-/-小鼠杂交。高脂饮食（HFD）喂养12周后， 研究者发现C/EBPβ+/-或AEP的敲除均可降低ApoE-/-小鼠的体重（图1A）和血清总胆固醇及LDL，而HDL水平无显著变化（图1B-D），表明C/EBPβ/AEP 对巨噬细胞中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平至关重要。大体主动脉及主动脉根部的油红O染色均表明，与ApoE^-/-小鼠相比，C/EBPβ/AEP通路的失活显著降低了主动脉斑块的病变区域（图1E-H）。且免疫荧光（IF）共染色显示，小鼠主动脉中CD68⁺巨噬细胞的病变区域降低（图1I-K）。因此，C/EBPβ/AEP信号通路的抑制能够减少ApoE^-/-小鼠主动脉斑块中泡沫化的巨噬细胞和斑块形成。

图1 C/EBPβ/AEP的失活降低ApoE^-/-小鼠的动脉粥样硬化

（图源：J Liao, et al., Mol Psychiatry, 2022）

脑血管粥样硬化引起的低灌注和缺氧可能会增加Aβ的产生，进而可能通过血管氧化应激和内皮功能障碍促进动脉粥样硬化病变的形成，导致额外的血管损伤。研究者将ApoE^-/-小鼠与3xTg小鼠杂交，以探究ATH对AD病理学的影响，反之亦然。结果表明，与ApoE^-/-小鼠相比，3xTg/ApoE^-/-小鼠的ATH加剧，这与之前发现的ApoE^-/-小鼠的ATH病变因人类APP突变体的过表达而显著增加相吻合。

为了研究C/EBPβ/AEP信号在此事件中的作用，研究者用3xTg/ApoE^-/-小鼠与C/EBPβ^+/-或AEP^-/-小鼠杂交，HFD处理12周后发现，敲除C/EBPβ或者AEP导致小鼠的体重明显轻于3xTg/ApoE^-/-小鼠（图2A）。两种小鼠的血清TC和LDL-C水平均显著降低，而血清HDL浓度无显著差异（图2B-D）。主动脉和主动脉窦冷冻切片的油红染色表明，当C/EBPβ或AEP从3xTg/ApoE-/-小鼠中敲除时，病变区域减少（图2E-H）。此外，动脉积聚的 CD68+巨噬细胞大大减少（图2I-K）。因此，C/EBPβ/AEP信号的失活减弱了3xTg/ApoE^-/-小鼠中的动脉粥样硬化。

图2 C/EBPβ/AEP的失活缓解3xTg/ApoE^-/-小鼠的动脉粥样硬化

（图源：J Liao, et al., Mol Psychiatry, 2022）

作者发现3xTg AD小鼠模型中敲除ApoE增加ATH病变。为了评估这种效应是否会影响脑血流，研究者监测了指示LCBF的激光多普勒血流测量热图。发现ApoE^-/-小鼠的脑血流低于3xTg小鼠，这表明，与3xTg AD小鼠模型相比，ApoE^-/-小鼠的动脉脂质积累降低了血流量，而C/EBPβ或AEP的敲除升高了3xTg/ApoE^-/-小鼠中的脑血流（图3A, B）。皮质中FITC-白蛋白（绿色）和 Aβ（红色）IF共染色表明血管长度与CBF活动密切相关（图3C, D）。相比之下，血管Aβ沉积物与脑血流量成反比（图3E）。皮质中4HNE（红色）染色发现3xTg/ApoE^-/-小鼠在ApoE KO和3xTg小鼠中表现出最强的氧化应激，敲除C/ EBPβ或AEP显著降低了3xTg/ApoE^-/-小鼠的氧化应激（图3 F, G）。与升高的氧化应激一致，IF与皮质中的抗Iba1（红色）和抗C/EBPβ（绿色）或抗 AEP（绿色）共染色显示活性小胶质细胞（Iba1⁺，红色）在 3xTg/ApoE^-/-小鼠中含量最高，C/EBPβ或AEP的敲除使得它们被抑制（图3H-J），表明氧化应激与3xTg/ApoE^-/-小鼠的神经炎症密切相关，并且C/EBPβ或AEP的敲除均可改善3xTg/ApoE^-/-小鼠中的炎症。因此，这些观察结果表明粥样动脉硬化诱导的脑灌注不足促进了AD的病理发展。

图3 C/EBPβ/AEP的失活减轻3xTg/ApoE^-/-小鼠的脑血管功能障碍。

（图源：J Liao, et al., Mol Psychiatry, 2022）

粥样动脉硬化是散发性AD发病机制的重要促成因素。为了剖析C/EBPβ/AEP信号传导在介导粥样动脉硬化和AD发病机制中的病理作用，研究者对上述小鼠的脑组织进行了免疫印迹（IB）分析。与ApoE^-/-或3xTg小鼠相比，3xTg/ApoE^-/-小鼠的C/EBPβ/AEP信号通路显著激活（图4A, B）。ApoE^-/-、3xTg和3xTg/ApoE^-/-小鼠大脑中Aβ40和42的浓度逐渐增加，而C/EBPβ或AEP的敲除降低3xTg/ApoE^-/-小鼠中Aβ40和42的浓度（图4C）。IF共染色验证了NeuN阳性神经元中的C/EBPβ和AEP荧光强度在IB分析中忠实地反映了它们的蛋白质水平（图4D,E）。且C/EBPβ/AEP信号传导的失活减少了3xTg/ApoE^-/-小鼠脑中Tau N368 片段化和Tau过度磷酸化，神经元死亡（图4F,G）及树突棘的减少。Morris水迷宫、恐惧条件反射测试及探测实验均表明：C/EBPβ或AEP的敲除可显著改善3xTg/ApoE^-/-小鼠的认知障碍（图4H-L）。

图4 C/EBPβ/AEP缺乏可减轻3xTg/ApoE KO小鼠的认知障碍。

（图源：J Liao, et al., Mol Psychiatry, 2022）

为了进一步确定脑粥样动脉硬化在AD病理学中的病理作用，研究者使用3xTg、3xTg/C/EBPβ^+/-和3xTg/AEP^-/-小鼠并注射AAV-shRNA以特异性敲低海马中的小鼠ApoE，然后HFD饲喂2个月。结果表明，初始体重无差异的情况下，无论海马中ApoE是敲低，C/EBPβ/AEP途径的敲除均会显著降低3xTg小鼠的体重和体重增量，且显着降低了血清LDL-C水平。其中AEP敲除降低了3xTg小鼠血清胆固醇和LDL-C水平，而HDL水平保持稳定。主动脉的油红染色显示，海马ApoE的敲低不影响 3xTg小鼠的主动脉病变。IB分析表明，海马中的ApoE被AAV-shRNA显著敲低并在皮质中减少，而肝脏中的ApoE水平保持不变。定量分析显示，通过ELISA试剂盒测量的血清中的ApoE水平无显著变化。3xTg小鼠的海马中敲低ApoE显著降低脑血流量（图5A,B）和血管长度（图5C-E），增加氧化应激（图5F,G）和小胶质细胞活性（图5H-J），C/EBPβ或AEP的敲除可逆转上述情况。总之，这些数据表明：从3xTg小鼠的海马中根除ApoE会引起脑粥样动脉硬化和脑灌注不足，这与强烈的氧化应激和神经炎症有关，C/EBPβ/AEP通路的失活可缓解这些症状。

图5 ApoE敲低激活C/EBPβ/AEP通路并加剧3xTg小鼠的脑血管功能障碍。

（图源：J Liao, et al., Mol Psychiatry, 2022）

接下来，研究者检查了这些动物中与AD相关的生理指标。IB分析显示，3xTg小鼠中ApoE的敲低显著激活了C/EBPβ/AEP信号通路，因此APP N585和Tau N368明显增加，这些事件在 3xTg/C/EBPβ^+/-或3xTg/AEP^-/-小鼠中减少或阻断（图6A）。且AEP酶活性与活性AEP剪切产物的蛋白质水平正相关（图6B）。海马体中ApoE 的敲低显著增加了3xTg小鼠的Aβ40和Aβ42浓度，而C/EBPβ/AEP信号的抑制可逆转该增高（图6C）。IF共染证实 ApoE的敲低明显提高了3xTg小鼠NeuN阳性神经元中C/EBPβ和AEP的表达，与神经元凋亡相关，C/EBPβ或AEP的敲低明显改善了这种情况（图6D-G）。且3xTg小鼠海马中ApoE的敲除导致AEP剪切产物Tau N368和p-Tau AT8活性增加、Aβ42和p-Tau聚集及树突棘的减少，而抑制C/EBPβ/AEP 信号逆转了上述现象。Morris水迷宫和恐惧条件认知测试表明，海马中ApoE的敲除使得3xTg小鼠的学习和记忆功能明显受损。抑制C/EBPβ或AEP有效挽救了3xTg/ApoE^-/-小鼠认知缺陷（图6H-L）。因此，在3xTg小鼠海马中敲除ApoE会增强Aβ浓度和神经元变性，从而引发认知功能障碍，其中C/EBPβ/AEP 通路是必不可少的。

图6 C/EBPβ/AEP失活减轻了3xTg小鼠海马中ApoE缺失引起的AD病理和认知功能。

（图源：J. Liao, et al., Mol Psychiatry, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究使用3xTg和APOE^-/-动物模型研究了C/EBPβ/AEP通路在粥样动脉硬化和AD发病机制中的生物学作用。小鼠模型中C/EBPβ或AEP的敲除证明了C/EBPβ/AEP通路的失活显著减少ox-LDL、炎症、巨噬细胞和近端主动脉和冠状动脉的病变区域。这些观察结果表明，C/EBPβ/AEP信号通路与粥样动脉硬化发病机制有关。老年痴呆和粥样动脉硬化代表一系列由血管受累诱发的相关疾病，尽管两种疾病的血管受累部位不同。值得注意的是，本研究表明3xTg/ApoE^-/-小鼠表现出脑血流受损，并伴有脑血管长度缩短。3xTg/ApoE^-/-小鼠的C/EBPβ/AEP信号失活可缓解这些血管疾病。在3xTg小鼠的海马中局部敲除ApoE观察到类似的现象（图3和5）。这些发现表明，ApoE在介导老年痴呆和粥样动脉硬化的脑血管功能障碍中起重要作用，支持粥样动脉硬化诱导的脑灌注不足通过C/EBPβ/AEP信号通路加速了AD的病理表现。总之，该研究表明C/EBPβ/AEP通路与ATH和AD密切相关，未来可以探索AEP抑制剂是否可用作治疗这两种疾病。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41380-022-01556-0

通讯作者叶克强教授

（照片提供自：叶克强实验室）

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制版︱王思珍

本文完